1．大肠杆菌能生产糖蛋白吗？
人民教育出版社生物室 陈 香
我们根据以往的知识分析得知，大肠杆菌无法生产糖蛋白，但是干扰素是不是一定就是糖蛋白呢？根据生物学书中的定义，干扰素是哺乳动物细胞在诱导物的诱导下产生的一种特异糖蛋白，由此可知，由哺乳动物细胞分泌的天然干扰素是糖蛋白，但是这并不意味着由基因工程技术生产的重组人干扰素就一定是糖蛋白。我们知道，将逻辑推理运用于解决生物学问题时，如果不考虑生物学问题的特殊性，有可能会导致过于绝对化的。比如，人教版《高中生物必修2遗传与进化》中有一个探究活动“脱氧核苷酸序列与遗传信息的多样性”[2]，这个探究活动探讨了由4种碱基排列而成的脱氧核苷酸序列是否足以表达生物体必需的各种遗传信息。理论上，由4种碱基排列而成的脱氧核苷酸序列有4n种可能，远远多于生物体实际存在的脱氧核苷酸序列的数目，但这里的推理结论的成立依赖于一个假设：所有碱基对的随机排列都能构成基因。事实上，大部分碱基对的随机排列不能构成基因，即不能成为生物体的遗传信息，但是因为理论上计算出来的脱氧核苷酸序列数目要远大于实际数目，所以这并不影响推导的过程和结论。同样，在大肠杆菌生产干扰素这个案例里，如果要使大肠杆菌生产干扰素即大肠杆菌能生产糖蛋白这个命题成立，也存在一个假设，即基因工程方法生产的干扰素和天然的干扰素一样，都是糖蛋白。但是，据科学家的研究资料显示[3-5]，用大肠杆菌生产出来的干扰素是没有糖链的，但同样能够抑制病毒在细胞内的增殖，加强巨噬细胞的吞噬作用和对癌细胞的杀伤作用。由此可知，该假设对于大肠杆菌表达系统并不成立，大肠杆菌可以生产干扰素，但没有证据表明大肠杆菌能生产糖蛋白。
既然基因工程方法生产出来的干扰素没有糖链也能发挥作用，那哺乳动物细胞为何要“多此一举”给干扰素加上糖链呢？糖链之于糖蛋白的意义是什么？一方面，真核细胞的糖基化体系给蛋白加上糖链后，能够帮助蛋白折叠成正确的构像，同时糖蛋白分子表面的极性糖链有助于蛋白质的溶解，防止蛋白聚集沉淀，从而能使糖蛋白分泌到细胞外。而在大肠杆菌表达系统中，由于缺乏糖基化体系，表达的非糖基化蛋白常常会在细菌体中聚集成不溶性的包涵体（inclusion body）。所谓包涵体，是指由于表达部位的低电势以及外源蛋白分子的特殊结构如Cys含量较高、低电荷、无糖基化等，使得外源蛋白与其周围的杂蛋白、核酸等形成的不溶性聚合体。包涵体中的蛋白是没有生物活性的，需要通过后续的溶解、纯化、复性等操作帮助变性的包涵体蛋白折叠成有生物活性的蛋白。科学家用基因工程的方法在大肠杆菌细胞内获得的干扰素就是以包涵体的形式存在的，因此，最初获得的干扰素是没有活性的，通过之后的纯化、复性等一系列的操作，科学家才得到了有生物活性的重组人干扰素。另一方面，糖链对蛋白的稳定性和半寿期（half life，一种物质其质量的一半被代谢或排出所需的时间）有一定的影响，一些糖蛋白在去除糖链后虽然仍具有一定的生物活性，但是易被蛋白酶降解。因此，真核细胞表达的干扰素需要糖链来稳定结构、帮助溶解，并通过转运系统分泌到细胞外，进入血液循环系统，以发挥其抗病毒抗肿瘤的生物功效。
大肠杆菌是不是就一定不能生产糖蛋白呢？在上个世纪，也许不可能，但是现在，随着科学技术的发展和科学研究的进一步深入，科学家们发现在一种名为Campylobacter jejuni的细菌里存在生产糖蛋白的基因簇，即pgl基因簇，此基因编码的蛋白能够起糖基转移酶的作用，科学家用基因工程方法将这套基因克隆至大肠杆菌共表达，使得大肠杆菌也能够生产相应的糖蛋白[6］。虽然大肠杆菌生产糖蛋白与真核细胞生产糖蛋白在合成机理、糖链结构等方面有很多差异，而且用大肠杆菌生产糖蛋白还处于实验室探索研究的阶段，但相信随着这方面研究工作的不断开展，有希望在不久的将来研发出一套成本低、产量高、质量好的大肠杆菌重组糖蛋白表达系统。
2．对海南省洋浦实验中学李存琴老师的答复
人民教育出版社 陈 香
人教社生物室编辑老师，您好！在高三年级与学生共同复习时遇到以下两个教学问题，请帮助解答：
1.人教版《普通高中课程标准实验教科书 生物 选修3 现代生物科技专题》教材45页“……培养帖附性细胞时,细胞要能够贴附于底物上才能生长增殖,这就要求培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒，易于帖附。”学生问：为什么内表面光滑、无毒，易于帖附？光滑应该不易帖附啊？
2. 人教版《普通高中课程标准实验教科书 生物 选修3 现代生物科技专题》教材48页图2-21 体细胞核移植过程流程图，为什么是“将供体细胞注入去核卵母细胞”而不是“将供体细胞的细胞核注入去核卵母细胞”？如注入的是供体细胞，为什么叫“核移植技术”呢？如注入的是供体细胞，那么供体细胞的细胞质中的遗传物质不也能表达出相应性状吗？
下面是生物室陈香老师对以上两个问题的答复。
1.培养细胞时,培养瓶或培养皿内表面光滑、无毒，易于细胞贴附，但是内表面光滑应该不易于细胞贴附啊？
答：高中生物选修3教材P45图2－16展示了动物细胞培养的流程，细胞悬液刚转入培养瓶时，细胞悬浮在培养瓶中，过一会细胞会下沉到瓶底，贴附到瓶底内表面上，然后进行生长增殖。所以，培养瓶内表面光滑时，细胞才能贴到瓶底，在瓶底铺成稀疏的一层，然后随着细胞的生长分裂，细胞长满瓶底，由于细胞之间会接触抑制，因此细胞在形成比较致密的一薄层后就停止增殖，此时应该分瓶传代。如果培养瓶内表面不光滑，细胞沉到瓶底时，不易在瓶底铺成一层，不利于细胞的生长增殖。
2.体细胞核移植过程流程图中，为什么是“将供体细胞注入去核卵母细胞”而不是“将供体细胞的细胞核注入去核卵母细胞”？如注入的是供体细胞，为什么叫“核移植技术”？供体细胞的细胞质中的遗传物质是否也能表达出相应性状？
答：体细胞核移植技术最初是用玻璃微型吸管将供体细胞的细胞核吸出，再注入到去核卵母细胞内，后来发展出了另外一种方法，即直接将供体细胞注入到去核卵母细胞透明质内，然后用病毒介导或者电脉冲等方式使两个细胞融合，因为这种方法操作简便，对卵母细胞损伤较小，现在较为常用，多莉羊的产生就是用的这种方法。因为供体细胞的细胞核拥有完整的遗传信息，对后代的性状表达起决定性的作用，线粒体DNA编码的基因很少，表达的蛋白主要存在于线粒体中，与线粒体自身氧化磷酸化产生能量的功能相关，与后代的性状表达并没有很大的关系。但是核移植后的细胞质中同时存在供体细胞和受体细胞的线粒体，到底这些线粒体是可以共存，还是一种消失一种保留，这个还处于研究阶段。
3．关于细胞培养的几个问题
1．原代培养和传代培养的概念
从机体上获取的组织，通过酶或机械方法分散成单个细胞进行培养，在首次传代前的培养一般称为原代培养。原代培养的最大优点是：组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养，也就是将细胞按1:2～1:4的比例传代。但严格说来，不论在进行传代时稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养。
传代代数与细胞的世代（增殖代数）并不是同一个概念。在细胞培养时，所说的“第10代细胞”，仅指该细胞已经传代10次；细胞传一代后，一般能倍增3～6次，经过三个阶段，即潜伏期、指数生长期和平台期。当细胞达到平台期时，就需要进行传代培养，否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至死亡。
2．关于传代培养
在进行传代时，如果是悬浮细胞，只需简单稀释即可，若需完全更换培养液只需低速离心沉淀，再悬浮于合适的培养液中即可。一般细胞每毫升接种数量为5×104～8×105个，传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。在培养过程中，培养液会由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代，多数细胞需用胰蛋白酶处理将细胞从生长物表面分离下来，以促进传代培养。
3．关于CO2培养箱
细胞培养中所用的培养箱一般称为CO2培养箱，它的气体环境是95%的空气和5%的CO2。由于某些资料中误把“空气”写成“氧气”，导致很多教师有疑问，不停地来信来电询问。CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持培养液的pH有直接关系。动物细胞多数需要微碱性环境，pH为7.2～7.4，以不超出6.8～7.6为宜。在细胞培养过程中，随着CO2释放量的增多，培养基会变酸，因此常加入NaHCO3（与CO2溶于水后所形成的H2CO3构成一个缓冲对）来调节pH。NaHCO3具有释放CO2的倾向，加入CO2可以抑制这个反应的进行。培养箱中CO2浓度应与培养液中NaHCO3浓度相平衡，如果培养箱中CO2浓度设定在5%，培养液中NaHCO3的加入量应为1.97 g/L；如果CO2浓度维持在10%，则NaHCO3的加入量应为3.95 g/L。
还有老师问到，如果气体环境改为95%氧气和5%的CO2，行不行？显然是不行的。氧气是一种氧化剂，浓度太高，会损伤细胞的。在有些细胞培养中，还需要加入抗氧化剂如巯基乙醇等。
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