主题：线粒体氧化体系

线粒体内的生物氧化过程实际上就是生成二氧化碳、水、能量的过程。二氧化碳的生成过程已在讲三羧酸循环时介绍了，本节重点讨论水和能量的生成过程。

    线粒体内的生物氧化依赖于线粒体内膜上一系列酶或辅酶的作用。它们作为递氢体或递电子体，按一定的顺序排列在内膜上，组成递氢或递电子体系，称为电子传递链。该传递链进行的一系列连锁反应与细胞摄取氧的呼吸过程相关，故又称为呼吸链。代谢物脱下的氢经呼吸链传递给氧生成水，同时伴有能量的释放。一、呼吸链的主要组成成份

组成呼吸链的主要成份有以下五类：

1．NAD+（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸又称辅酶Ⅰ）

它是体内许多不需氧脱氢酶的辅酶，将作用物的脱氢与呼吸链的传递氢过程联系起来，是递氢体。NAD+中的尼克酰胺（维生素PP）能进行可逆的加氢和脱氢反应，每次只能接受一个氢原子和一个电子，另一质子则留在介质中，所以还原型辅酶Ⅰ写成NADH+H+。

2．黄素蛋白或黄素酶（FP）

黄素蛋白的种类很多如琥珀酸脱氢酶、脂酰CoA脱氢酶等，其辅基只有两种：FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）、FMN（黄素单核苷酸）。两者均含核黄素（维生素B2）。FAD、FMN中的异咯嗪部分可进行可逆的加氢和脱氢反应，故也是递氢体，每次可接受两个氢原子即FADH2。

3．铁硫蛋白（Fe－S）又称铁硫中心

其特点是含有铁原子和硫原子，铁与无机硫原子或是蛋白质分子上的半胱氨酸残基的硫相结合。常见的铁硫蛋白有三种组合方式。铁硫蛋白是电子传递体，其中的铁能可逆地进行氧化还原反应，每次只能传递一个电子。在呼吸链中，铁硫蛋白多与黄素蛋白或细胞色素b结合成复合物存在。如图所示

4．泛醌（UQ）又称辅酶Q（COQ）

为一脂溶性醌类化合物，广泛存在于生物界。其能可逆地进行加氢和脱氢反应，所以是递氢体。结构如图所示

5．细胞色素体系（Cyt）

细胞色素是一类以铁卟啉为辅基的结合蛋白质，此类蛋白质的颜色来自铁卟啉。根据其吸收光谱的不同可分为三大类：Cyt a、Cyt b、Cyt c。每类又可分为若干种，其中主要细胞色素有a、a3、 b、c、c1、b5、P450等。除b5和P450主要存在于微粒体外，大部分细胞色素存在于线粒体内膜中，并与内膜紧密结合，只有Cyt c结合较松。细胞色素作为递电子体，其中铁卟啉中的Fe离子能进行可逆的氧化还原反应。

结构如图所示

   注：细胞色素a、a3很难分开，组成一复合体称为细胞色素aa3，它是呼吸链中最后一个递电子体，接受电子后直接将电子传递给氧，将氧激活为氧离子（O2-）故也称为细胞色素氧化酶。

二、呼吸链的电子传递顺序

呼吸链中各递氢体和递电子体按一定的顺序排列。目前被普遍承认的顺序如图所示。

    由此可见，线粒体内存在两条呼吸链即NADH氧化呼吸链和FADH2氧化呼吸链。

1．NADH氧化呼吸链

由辅酶Ⅰ、黄素蛋白、铁硫蛋白、辅酶Q和细胞色素组成。体内多种代谢物如苹果酸、乳酸、丙酮酸、异柠檬酸等在相应脱氢酶的催化下，脱下的氢都通过此条呼吸链传递给氧生成水。所以此条呼吸链为体内最重要的呼吸链。代谢物脱下的2H交给NAD+生成NADH+H+，后者又在NADH脱氢酶复合体作用下脱氢，经FMN传递给辅酶Q，生成COQ H2。以后COQ H2脱下2H=2H++2e，其中2H+游离于介质中，2e则首先由2Cyt b的Fe3+接受还原成2Fe2+，并沿着Cytb→Cytc1→Cytc→Cytaa3→O2的顺序逐步传递给氧生成O2-，O2-比较活泼，可与游离于介质中的2H+结合生成水。

2．FADH2氧化呼吸链

黄素蛋白（以FAD为辅酶）、辅酶Q和细胞色素组成。其与NADH氧化呼吸链的区别在于代谢物脱下的2H不经过NAD+这一环节，除此之外，其氢与电子的传递过程均与FADH氧化呼吸链相同。其组成和作用如上图所示。琥珀酸脱氢酶、脂酰CoA脱氢酶、a磷酸甘油脱氢酶催化代谢物脱下的氢均通过此呼吸链被氧化。这条呼吸链不如NADH氧化呼吸链的作用普遍。

呼吸链中各递氢体和递电子体的顺序排列是根据大量实验结果推出来的。

首先，根据呼吸链中各组分的氧化还原电位由低到高的顺序推出呼吸链中电子的传递方向为从NADH经辅酶Q、细胞色素体系到氧。如图所示

其次，利用呼吸链中的不少组分具有特殊的吸收光谱，而且得失电子后其吸收光谱发生改变。如NAD+因含AMP，故在260nm处有一吸收峰，而当还原成NADH+H+后，则在340nm处出现一个新的吸收峰；FP因含黄素在370nm和450nm处有吸收峰，但当还原后，450nm处的吸收峰消失。因此在其全部处于还原状态时，缓慢通入氧气，利用分光光度法测定各组分的吸收峰的改变顺序，从而判断呼吸链中各组分的排列顺序。所得结果与第一种方法相同。

第三，利用一些特异的抑制剂阻断呼吸链的电子传递，那么阻断部位以前的电子传递体就会处于还原状态，而阻断部位以后的电子传递体则处于氧化状态。因此通过分析不同阻断情况下各组分的氧化还原状态，就可推出呼吸链各组分的排列顺序。

另外，当用去垢剂温和处理线粒体内膜时，得到了四种电子传递复合体。它们也按一定的顺序排列。这四种复合体为：

1．复合体Ⅰ 又称NADH脱氢酶复合体，包括多种蛋白质，其中有黄素蛋白（以FMN为辅基）、铁硫蛋白。NADH脱下的氢经此复合体中的黄素蛋白和铁硫蛋白传递给辅酶Q。

    辅酶Q为脂溶性，分子较小且不与任何蛋白质结合，可在呼吸链的不同组分间穿梭游动而传递电子。它接受氢后将质子（H+）释放入线粒体基质内，并把电子传递给细胞色素。

2．复合体Ⅱ 即琥珀酸脱氢酶，它是三羧酸循环中唯一的膜结合蛋白，至少含有四种蛋白质，其中一个通过共价键与一分子FAD和一个铁硫蛋白结合，琥珀酸脱下的氢经FAD、铁硫蛋白传递给辅酶Q。

3．复合体Ⅲ 又称泛醌细胞色素C氧化还原酶，含有铁硫蛋白、细胞色素b及c1等。它将还原型辅酶Q中的电子传递给细胞色素C。

    细胞色素C分子量较小，与线粒体内膜结合疏松，可在线粒体内膜中移动，将电子传递给复合体Ⅳ。

4．复合体Ⅳ 又称细胞色素氧化酶，包括细胞色素a及a3。此复合体将电子传递给氧生成O2-。

三、生物氧化过程中ATP的生成

不同的化学键所贮存的能量并不一样。所以有的键水解时释放的能量较少；而有的则释放的能量较多，称为高能键。体内最主要的高能键是高能磷酸键。含有高能键的化合物称为高能化合物，体内最重要的高能化合物是ATP。机体能量的释放、贮存、利用都以ATP为中心，ATP是生物界普遍的供能物质，有"通用的能量货币"之称。ATP的分子结构如图所示，含有三个磷酸、两个高能磷酸键，由于ATP带有负电荷，有人认为其生理存在形式系与两价金属阳离子（Mg2+）螯合，ADP也能与Mg2+螯合，但两者的亲和力远较ATP弱。

注：某些化合物或键的结构排列为何呈现高能？其原因是多方面的，如静电斥力，即在生理pH下ATP中的氧原子带负电荷，它们之间相互排斥形成键张力，因此ATP分子内必须具有足够内能才能克服酸酐键的键张力。ATP水解时酸酐键断裂，使分子内维持其张力的内能释放出来，因此ATP水解有较大的－ΔG0'。

体内ATP的生成方式有两种：作用物（底物）水平磷酸化和氧化磷酸化。

（一）作用物（底物）水平磷酸化

在高能化合物放能过程的同时，伴有ADP磷酸化生成ATP的作用称为作用物（底物）水平磷酸化，与呼吸链的电子传递无关，也无水生成。也就是说，高能化合物直接将其高能键中贮存的能量传递给ADP，使ADP磷酸化生成ATP，此类反应需在酶的催化下完成。

    通过作用物（底物）水平磷酸化生成的ATP在体内所占比例很小，如1mol葡萄糖彻底氧化产生的36或38molATP中，只有4或6 mol由作用物（底物）水平磷酸化生成，其余ATP均通过氧化磷酸化产生。

（二）氧化磷酸化

代谢物脱下的氢经呼吸链传递给氧生成水，同时逐步释放能量，使ADP磷酸化生成ATP，这种氧化与磷酸化相偶联的过程称为氧化磷酸化。如图所示氧化过程为放能反应或称分解代谢，磷酸化则为吸能反应或称合成代谢，所以体内的吸能与放能反应总是偶联进行的，一个吸能反应无法独立进行。

   如果只有代谢物的氧化过程,而不伴有ADP磷酸化的过程，称为氧化磷酸化解偶联。

1．氧化磷酸化的偶联部位

根据测定不同作用物经呼吸链氧化的P/O比值，可大致推出偶联部位。P/O比值是指每消耗一克原子氧所需消耗无机磷的克原子数。如P/O比值接近3，则认为生成3分子ATP；如接近2，则认为生成2分子ATP。已知β-羟丁酸氧化时生成的NADH进入呼吸链经黄素蛋白（FMN）、辅酶Q等传递给氧生成水，测得P/O比值接近3，即生成3分子ATP。琥珀酸氧化时经黄素蛋白（辅基为FAD）、辅酶Q等传递给氧生成水，测得P/O比值接近2，即生成2分子ATP。说明在NADH-COQ之间，存在偶联部位。此外，测得抗坏血酸氧化时P/O比值接近1，还原型细胞色素C氧化时P/O比值也接近1，说明在Cytaa3→O2之间存在偶联部位。另外在COQ-细胞色素C之间必然存在一偶联部位。

    通过化学计算能量释放所得结果与上述测定P/O比值所得结果完全相同。呼吸链中各氧化还原对都具有不同的氧化还原电位，而且从呼吸链开始端至末端，氧化还原对的电位逐渐升高，即两个相邻的氧化还原对之间存在着电位差。当电子从一个氧化还原电位较低的还原型递体转移到较高电位的氧化型递体时，就有负自由能变化，即能量的释放。因此，沿着呼吸链的电子传递过程实质上是一个放能过程。所释放的能量约有60%以热能形式释放，其余则以化学能形式存储与ATP中。当氧化还原对之间的电位差大于0.2V时，既有1摩尔ATP生成。经测定，NADH→COQ之间的电位差约为0.33V，Cytb→Cytc之间的电位差约为0.31V，Cytaa3→O2之间的电位差约为0.58V，均大于0.2V，所以此三个部位就是氧化磷酸化的偶联部位。这样，代谢物脱下的氢经NDAH进入呼吸链生成水，可生成3分子ATP；若经FADH2进入呼吸链生成水，可生成2分子ATP。

2．氧化磷酸化的机制

目前，普遍被接受的学说是由Peter Mitchell于1961年创立的化学渗透学说，其原理如图所示。其基本要点是：电子经呼吸链传递的同时，将质子从线粒体内膜基质侧排到内膜外（膜间隙），而线粒体内膜不允许质子自由回流，所以造成膜内外的电化学梯度。这种电化学梯度既包括[H+]梯度，又有跨膜电位差。电化学梯度的形式可看作能量的储存，它由电子传递时释放出的能量引起。当质子顺梯度回流时则驱动ADP与Pi合成ATP。呼吸链中的四个复合体排列在线粒体内膜上，它们在传递电子时可将质子从线粒体基质侧泵到内膜外，称为质子泵作用。每个复合体泵出的质子数还不清楚，估计当一对电子沿呼吸链传递到氧时大约泵出10个质子。

    ATP是在位于线粒体内膜上的ATP合成酶催化下生成的。ATP合成酶是一个大的膜蛋白复合体，主要由两部分组成：疏水的F0、亲水的F1。F0区主要构成质子通道，其由3～4个亚基组成，其中一个称为寡霉素敏感蛋白（OSCP），F1区由9个亚基组成，其中a、b亚基上有ATP结合部位。在生理条件下，质子只能从线粒体内膜外侧流向基质侧。目前对在质子回流时，能量如何转移到ATP合成酶上并催化ADP磷酸化生成ATP的还不清楚。

3．影响氧化磷酸化的因素

ADP和ATP的调节

氧化磷酸化的进行有赖于ADP和Pi（无机磷）的供应。线粒体内，Pi的含量足够用，因此ADP的水平对氧化磷酸化具有重要的调节作用。当ADP↑或ATP↓时，氧化磷酸化加速；反之，当ADP↓或ATP消耗减少时，氧化磷酸化减慢，此时体内合成代谢必然加速（由小分子合成复杂大分子的合成代谢是一个耗能过程）。所以，ADP与ATP的比值是调节氧化磷酸化的重要因素。这种调节作用可使机体能量的产生适应生理需要，在合理利用和节约能源上有重要意义。

甲状腺素的调节作用

甲状腺素可活化许多组织细胞膜上的Na+－K+－ATP酶，使ATP加速分解为ADP和Pi，ADP进入线粒体的数量增加，使氧化磷酸化反应增强。由于ATP的合成和分解速度均增加，导致机体耗氧量和产热量均增加，基础代谢率提高，基础代谢率偏高是甲状腺机能亢进病人最主要的临床指征之一。（减肥－节食加运动。节食会导致甲状腺素T3分泌减少，从而导致基础代谢率下降，减肥效果差，所以需加上适当运动，并长期坚持下去才可得到较好的减肥效果。）

氧化磷酸化作用的抑制剂

抑制氧化磷酸化会对机体造成严重后果。氧化磷酸化抑制剂分为两大类：一类是电子传递抑制剂（呼吸链阻断剂）可抑制呼吸链的不同部位，使作用物氧化过程（电子传递）受阻，偶联磷酸化也就无法进行，ATP生成也就随之减少；另一类是解偶联剂，可使氧化与磷酸化脱节，以致氧化过程照常进行，但不能生成ATP。氧化磷酸化抑制剂主要用作研究的电子传递链中各组分的排列顺序和氧化磷酸化机制及作为杀虫剂等。

常见的电子传递抑制剂（呼吸链阻断剂）有鱼藤酮、粉蝶霉素A、异戊巴比妥等，它们与复合体Ⅰ中的铁硫蛋白结合，从而阻断电子传递；抗霉素A、二巯基丙醇（BAL）可抑制复合体Ⅲ中cytb与cytc1间的电子传递；H2S、CO、CN－等抑制细胞色素氧化酶，使电子不能传递给氧。此外，寡霉素可与ATP合成酶的OSCP亚基结合，阻止了H+从质子通道回流，磷酸化过程无法完成。还有一种铁螯合剂（简称TTFA）可特异抑制还原当量从FP（辅基为FAD）至辅酶Q的传递。如图所示

    解偶联剂中最常见的是2,4－二硝基苯酚，为脂溶性物质，可在线粒体内膜中自由移动，将H+从内膜外侧搬运至内侧，从而使质子梯度遭到破坏，ATP无法生成，导致氧化磷酸化分离。过去曾将2,4－二硝基苯酚用作减肥药。氧化磷酸化解偶联作用可发生于新生儿的棕色脂肪组织（也称为褐色脂肪组织，其中含有较多的线粒体、细胞色素，血液供应也较多，比白色脂肪组织易分解供能），其线粒体内膜上有解偶联蛋白，可使氧化磷酸化解偶联。新生儿可通过此种机制产热以维持体温。

四、线粒体外NADH的转运

线粒体内生成的NADH和FADH2可直接参加氧化磷酸化过程，但在胞液中生成的NADH不能自由透过线粒体内膜。故线粒体外NADH所携带的氢必须通过某种转运机制才能进入线粒体，然后再经呼吸链进行氧化磷酸化。转运NADH的机制主要有：苹果酸-天冬氨酸穿梭作用、α-磷酸甘油穿梭作用。

1．苹果酸－天冬氨酸穿梭作用

此穿梭机制比较复杂。如图所示，胞液中的NADH在苹果酸脱氢酶催化下，使草酰乙酸还原为苹果酸，后者可通过线粒体内膜上的载体进入线粒体。在线粒体内的苹果酸脱氢酶作用下重新生成草酰乙酸和NADH：NADH进入NADH氧化呼吸链生成3分子ATP；而草酰乙酸经谷草转氨酶（GOT，又称天冬氨酸转氨酶，AST）作用生成天冬氨酸和α酮戊二酸，后者可借线粒体内膜上的载体进入胞液，再转变为草酰乙酸，以继续穿梭作用。此穿梭机制主要存在于肝、肾、心等器官中。故在这些组织器官中糖酵解过程中3－磷酸甘油醛脱氢产生的NADH+H+可通过此穿梭机制进入线粒体中，生成3分子ATP，即1分子葡萄糖彻底氧化生成38分子ATP。

2．α－磷酸甘油穿梭作用

此穿梭机制主要存在于肌肉、神经细胞中。如图所示，胞液中的NADH可使磷酸二羟丙酮还原为α－磷酸甘油，此反应在α－磷酸甘油脱氢酶催化下完成。生成的α－磷酸甘油进入线粒体，再经位于线粒体内膜近外侧部的α－磷酸甘油脱氢酶催化生成磷酸二羟丙酮和FADH2，磷酸二羟丙酮可进入胞液继续穿梭，FADH2经复合体Ⅱ（FAD呼吸链）进入呼吸链生成2分子ATP。所以经此途径1分子葡萄糖彻底氧化生成36分子ATP。

五、ATP的利用与储存

虽然人类一切生理活动所需的能量主要来自糖、脂类等物质的分解代谢，但糖、脂类等物质中所蕴涵的能量必须转化为ATP形式方可被利用。所以ATP是机体所需能量的直接供给者。如肌肉收缩、神经传导、生物合成、吸收与分泌等过程所需能量均来自ATP。

    另外，在一些物质的合成过程中除需要ATP外还需其它高能磷酸化合物参与，如糖原合成过程中需要UTP，磷脂合成时需CTP，蛋白质合成时需GTP参与。但UTP、CTP、GTP等高能磷酸化合物的生成和补充有赖于ATP。

在肌肉和脑组织中，ATP可将其高能磷酸键转移给肌酸生成磷酸肌酸（CP），此反应由肌酸激酶（CPK）催化。磷酸肌酸为能量的贮存形式，其所含的高能磷酸键不能直接被利用，当肌肉和脑组织中ATP不足时，磷酸肌酸可将其高能磷酸键转移给ADP生成ATP，为生理活动提供能量。