9.6 微生物的分离
中学生开展微生物的培养观察活动，固然可以从有关方面获得菌种，但还应该学会自己动手，到自然界去收集各种微生物。
自然界的微生物，几乎都是混杂在一起的。人们要想观察、研究和利用某一种微生物，就必须将它从各种微生物混生的环境中分离开来。所以微生物的分离是一项十分重要的技术。
一、分离的基本方法
微生物分离的方法很多，主要有连续稀释分离法，平板划线分离法和单细胞分离法等方法。其中，单细胞分离法需要贵重精密仪器，中学无法开展，而连续稀释分离法和平板划线分离法却简便易行，中学完全具备开展条件。现将这两种方法说明如下。
1.连续稀释分离法
①取1克土样，在火焰旁放入装有99毫克无菌水的锥形瓶内，充分摇匀，将菌分散。
②用移液管吸取上述菌悬液1毫升，放入盛有9毫升无菌水的试管中，并进一步稀释成1000倍，即10-3的菌悬液。按10倍稀释法连续稀释到10-8（每1次稀释，都须更换移液管）。
③取3支1毫升移液管分别从10-8、10-7、10-6菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-8、10-7和10-6的培养皿内，同一稀释液重复做3个培养皿。
④将温度为45～50℃的营养琼脂培养基（其成分和配制方法见本章第三节）倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。
⑤经过一定时间培养后，培养基上长出菌落，根据菌落特征，初步判断属于何种类型的微生物，并在显微镜下检查，若菌体形态一致，则可认为是初步分离到纯菌种。
⑥将分离培养所得的纯菌种，从平板培养基转移到试管斜面培养基上培养。
2.平板划线分离法
①取1克土样，在火焰旁加进装有99毫升无菌水的锥形瓶中，堵塞棉塞，制成菌悬液待用。
②取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。应连续制作几份平板培养基。
③将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，应使平板培养基表面向下，以免空气中杂菌落入。接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。
④将划线后的培养皿倒放在28℃左右的温暖处进行培养，待长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。
连续稀释分离法和平板划线法，均须在无菌室或接种箱内进行。
二、各类微生物的分离
1.从土壤中分离好气性及兼性厌气细菌
其分离方法见本节“分离的基本方法”
2.从土壤中分离放线菌
①制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
②称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。振荡10分钟，制成10-1菌悬液。按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。
③用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。然后将培养皿倒置于25～30℃温箱中，培养7～10天，培养基上会出现微生物菌落。如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。
④挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。
3.从土壤中分离霉菌
①制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。将培养皿中，凝成平板，待用。
②称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。
③取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。然后将培养皿倒置于25～30℃温箱内培养3～4天。培养基上会出现微生物菌落。霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。
④挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上。
4.从饮水中分离大肠杆菌
①制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
②用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1：10稀释。
③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上。用平板划线分离法进行分离。
④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18～24小时。培养基中会出现大肠杆菌菌落，菌落中心呈暗蓝黑色，发金属光泽。
⑤将菌落接种于斜面培养基上（由营养琼脂培养基制成）。
三、微生物菌种的保藏
微生物菌种的保藏方法有斜面冰箱保存法、石蜡油封藏法、沙土保藏法和冷冻干燥保存法等。其中以斜面冰箱保存法最为简便。
斜面冰箱保存法的作法如下：
在平板上选择分离良好的细菌、放线菌和霉菌的纯种，分别接种于营养琼脂培养基、高氏一号培养基和豆芽汁葡萄糖琼脂培养基的斜面上，使其充分生长后，放在冰箱内4℃温度下保存。定期移种。这种方法虽然简便，但保存时间不能太长。一般霉菌、放线菌和有芽孢的细菌可保存半年左右，酵母菌可保存4个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右。超过上述时间，就需要进行移种。