10.4 外植体的选择与灭菌

一、外植体的选择

1.选择外植体时应考虑的各种因素

虽然所有的植物细胞都具有全能性，能够重新形成植株，但各种细胞在表现全能性、重新形成植株的能力并不相同。这种差别不仅表现在同一植株的不同部位、不同器官和不同组织上，而且还表现在植物种类、植株年龄、生长季节和生理状态上。因此，在决定选用一个合适的材料时，必须考虑以下一些因素：

①用哪一部分器官最适于作组织培养的材料；

②器官的生理状态和发育年龄；

③取材的季节；

④离体材料（外植体）的大小；

⑤取得离体材料的植株质量。

例如，许多兰科植物、石刁柏（Asparagus officinalis L.）和非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus ex Gard.）用茎尖作材料最合适，而旋花科植物用根比较合适，秋海棠和茄科的一些植物适合于用叶等等。一般说来，处于生长季节的较幼嫩的材料，容易培养，接种时较大的外植体则有较大的再生能力。对于仅仅诱导愈伤组织的外植体，材料大小并无严格限制，只要将茎的切段、叶、根、花、果实或种子等的组织切成片状或块状，接种在培养基上即可。切块的具体大小一般在0.5厘米左右，太小时产生愈伤组织的能力弱，太大时，又会在培养瓶中占地方太多。至于茎尖、胚、胚乳的培养，则按器官或组织单位切离即可。

2.外植体的两种类型

外植体可以分为带芽的外植体和由分化组织构成的外植体两种类型。

(1)带芽的外植体如茎尖和侧芽等。培养这类外植体时，可以有两种作法，一是诱导茎轴伸长，为此就要在培养基中多加入植物生长素和赤霉素；一是抑制主茎发育，促进腋芽最大限度生长，以产生丛生芽，为此则应在培养基中加入大量的细胞分裂素。选用带芽的外植体很有意义，因为这类外植体产生植株的成功率高，而且很少发生变异，容易保持材料的优良特性。

(2)由分化的组织构成的外植体。如茎段、叶、根、花茎、花瓣、花萼、胚珠、果实、花粉等。这类外植体大多由已分化的细胞组成，由它们再生成植株，大多有一个从分化状态回复到分生组织状态的脱分化过程。所以由这类外植体接种的材料，常常要经过愈伤组织阶段再分化出芽或胚状体而形成植株。由这类外植体形成的后代可能有变异。

二、外植体的灭菌

接种用的材料表面，常常附有多种多样的微生物，这些微生物一旦带进培养基，就会迅速滋生，使实验前功尽弃。因此，材料在接种前必须进行灭菌。灭菌时，既要将材料上附着的微生物杀死，同时又不能伤及材料。因此，灭菌采用何种药剂，什么浓度，处理多长时间，均应根据材料对药剂的敏感情况仔细敲定。

目前，经常使用的灭菌剂有次氯酸钠、过氧化氢、漂白粉、溴水和低浓度的氯化汞等。使用这些灭菌剂，都能起到表面杀菌的作用。但氯化汞灭菌后，汞离子在材料上不易去掉，必须将材料用无菌水多清洗几次。

外植体的灭菌工作应在接种室或接种箱内无菌的条件下进行。

下面介绍几种外值体的灭菌方法：

1.花药的灭菌

用于组织培养的花药，按小孢子发育时期要求，实际上大多没有成熟，花药外面有萼片、花瓣或颖片、稃片保护着，通常处于无菌状态。所以一般只对整个花蕾或幼穗进行灭菌。如茄（Solanum melongena L.）的花药，灭菌时先去掉花蕾的萼片，用70%酒精擦洗花瓣，然后将整个花蕾浸泡在饱和漂白粉上清液中10分钟，再经无菌水清洗2～3次，即可接种。这一灭菌程序，也适用于其它植物花药的灭菌。

2.果实及种子的灭菌

灭菌前，先将果实、种子用纯酒精迅速漂洗一下或将种子浸泡10分钟。对于果实，一般再用2%的次氯酸钠溶液浸泡20～30分钟甚至几小时，持续时间视种皮硬度而定。对用作胚或胚乳培养的种子，如种皮太硬，则在灭菌前先去掉外种皮，再用4～8%次氯酸钠溶液浸泡8～10分钟，用无菌水清洗后，即可剖出胚或胚乳进行接种。

3.茎尖、茎段及叶片的灭菌

灭菌方法与花药的灭菌方法相同。对于茎叶，因为暴露在空中，且生有毛或刺等附属物，所以灭菌前应该用自来水冲洗干净，用吸水纸将水吸干，再用70%酒精漂洗一下。然后，根据材料的老、嫩和枝条的坚硬程度，用2～10%次氯酸钠溶液浸泡6～15分钟，用无菌水冲洗3次，用无菌纸吸干后进行接种。

4.根和贮藏器官的消毒

这类材料大多埋于土中，材料上常有损伤及带有泥土。灭菌比较困难。灭菌前，要用自来水清洗，并用毛刷或毛笔轻轻刷洗去掉污物，吸干后用70%酒精漂洗一下，再用0.1～0.2%的氯化汞灭菌5～10分钟，或用6～8%次氯酸钠溶液浸5～15分钟，接着用无菌水清洗及用无菌纸吸干，然后进行接种。