10.5 组织培养的步骤
通过组织培养进行再生的步骤，包括接种、植株诱导、生根和移栽四个阶段。
一、接种
组织培养的接种是指将灭过菌的材料，在无菌的情况下，切成小块，放入培养基的过程。科研、生产部门的接种工作，多在无菌室或超净工作台上进行，中学可制作接种箱，在箱内进行接种。接种的方法步骤如下：
①在无菌室或接种箱中放好接种时所需要的酒精灯、贮存70%酒精和棉球的广口瓶、各种镊子、接种针、解剖刀、手术剪、火柴、培养基等。
②在无菌室或接种箱内用紫外灯灭菌（无菌室照射20～50分钟，接种箱照射15分钟）。
③放入已灭菌的接种材料（用培养皿盛取）。同时，操作人员用酒精棉球擦手，并对接种工具用酒精灯火焰烧灼。
④用手术刀片将材料切割成若干片段，并迅速接种入培养基中。接种时，锥形瓶（或试管）应斜向火焰，在酒精灯火焰附近操作。
⑤材料接种好后，将锥形瓶瓶口在酒精灯火焰上转动烧一遍，盖好瓶盖，注明材料名称及接种日期。
材料接种后，应置于26～28℃的培养室中进行培养。中学如果条件不具备，可于春、秋季温度适宜时放在室内培养，用日光灯或自然光照明，光强约在2000勒克斯左右。
二、植株诱导
本阶段是组织培养中最重要的一环。在培养基中植物激素的作用下，外植体通过三条途径迅速增殖，这就是侧芽增殖、诱导不定芽的形成和诱导胚状体的形成。
1.侧芽增殖
种子植物的每个叶腋中通常都存在着腋芽，在一定条件下可以使它生长。现在知道顶端优势抑制侧芽生长，可被外源的细胞分裂素打破，所以在利用侧芽增殖这条途径时，培养基中几乎都要加入细胞分裂素（有时也加入少量生长素）。由于细胞分裂素的持续作用，侧芽不断分化和生长，逐渐形成芽丛。如果反复切割和转移到新的培养基上继代培养，就可在短期内得到大量的芽。
侧芽增殖的主要优点是能保持遗传的稳定性，因为茎尖的细胞常是均一的二倍体细胞，它不易受培养条件的影响而发生变异，也易于保持嵌合体的性状。目前已有近百种植物可以用这种方法进行繁殖，如草毒（Fragaria ananassa Duch.）、苹果、葡萄（Vitis vinifera L.）、唐菖蒲（Gladiolus gandavensis Houtt.）、非洲菊、月季（Rosa chinensis Jacq.）、甜菜（Beta vulgaris L.）和凤梨[Ananas comosus（L.） Merr.]等。
关于培养基中加入细胞分裂素的浓度，是0.1～10.0毫克/升，一般为1.0～2.0毫克/升。在几种细胞分裂素中用的最多的是6-苄基嘌呤，其次是激动素和异戎基腺苷，玉米素用的很少。
除了细胞分裂素之外，在培养基中还经常加入低浓度的生长素以促进腋芽的生长。常用的生长素是萘乙酸、吲哚丁酸和吲哚乙酸（浓度为0.1～1.0毫克/升）。
2.诱导不定芽的形成
在自然条件下，很多种植物的器官可以产生不定芽。在培养条件下，由于所需要的外植体很小又加上激素的作用，可以使这种产生不定芽的能力得到极好的发挥，如秋海棠或非洲紫罗兰（Saintpaulia ionantha Wendl.）用常规的叶插法繁殖时，每片叶只能产生几个到十几个芽，但用叶切段在培养基中可产生成千上万个芽。在培养条件下，还能使自然条件下不产生不定芽的器官形成不定芽，如卷心菜（Brassica oleracea L.var.capi-tata L.）和番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）的叶、菊花[Dendranthema morifolium（Ram.） Tzvel.]的花和叶片、百合（Lilium brownii F.E.Br.var.viridulum Baker）和水仙的鳞片以及萱草（Hemerocallis fulva L.）的花茎等。
在诱导外植体形成不定芽时，一般使用细胞分裂素高于生长素比值的激素配比，少数情况下也采用二者比值接近1的配比。常用的细胞分裂素是6-苄基嘌呤，激动素和玉米素，浓度范围一般在0.1～10.0毫克/升。生长素是萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸，其浓度范围与细胞分裂素相同。为了使外植体形成不定芽，外源激素的供应只是一个方面，器官分化的性质还要决定于内源激素的状况。因此，对于不同的植物，使用的激素种类和浓度常有较大的变化。在具体操作时，应参考已有资料或相近种类的已有结果，以确定适当的浓度和配比。
3.诱导胚状体的形成
在自然界只有少数植物可以由珠心产生胚状体。在培养条件下，现在已有30多个科的150多种植物可以产生胚状体。在诱导胚状体的形成时，其外植体一般取自胚、分生组织或生殖器官。为了获得胚状体，在培养过程中，培养基中应含有丰富的还原氮，并加入生长素（主要是2，4-D）诱导胚状体的发生。待胚状体发生后，要转移到降低浓度或没有生长素的培养基上进行培养，使胚状体成熟和生长。
胚状体途径的优点是增殖率高，而且胚状体既具胚芽又具胚根。因此，可免去生根这一步骤。但目前很多重要作物还不能形成胚状体，或产生的胚状体难以形成植株，另外胚状体遗传性也容易发生变异，所以目前除柑桔（Citrus）、油棕（Elaeis guine-ensis Jacq.）和咖啡（Coffea）等少作物外，都不采用这一途径。
三、生根
生根是获得完整植株的一个关键。通过侧芽和不定芽途径产生的芽长成嫩枝后（此时的嫩枝叫试管苗），必须诱导生根才能移植。促使试管苗生根的方法通常有两种。一种是在固体培养基上诱导生根。当试管苗长到2～3厘米高时，将它从基部切下，转移到只含0.2～0.5毫克/升的萘乙酸或吲哚丁酸的固体培养基上生根。另一种是浸泡的方法，将切下的无根试管苗泡在含有高浓度生长素溶液中，生长素浓度为100毫克/升左右，浸泡时间从几小时到1天，然后取出接种于不加任何激素的MS培养基上，十天左右即可生根。
以上两种方法，在更换培养基后，经过几天，都要将试管苗的瓶口打开，上盖1～2层纱布，以便于通气。并要适当加强光照，以增加试管苗的自养能力。
四、移栽
当试管苗的根原基突起或形成几毫米长的短根时，将其取出，洗去琼脂，载入有少量营养的人工基质中。移栽后，保持高湿度，避免阳光直射和过大的温度波动，经过一段逐步锻炼的过程，再定植到土壤中。
在移栽过程中，试管苗的环境条件发生了剧烈的变化，其本身又从异养变到自养，叶的光合作用和根的吸收作用需要逐渐发展。因此移栽时要小心控制，使试管苗逐步锻炼，最终能在土壤中生活。