高二生物集体备课-选一-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段

一、课题目标
本课题通过尝试PCR（DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作，使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法，理解PCR的原理，讨论PCR的应用。
二、课题重点与难点
课题重点：PCR的原理和PCR的基本操作。
课题难点：PCR的原理。
三、课题背景分析
课题背景首先介绍了PCR是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术，然后说明这一技术在遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用，最后指出本课题的目标是了解PCR技术的基本原理，并尝试用PCR技术扩增DNA片段。教师在导入本课题的学习时，可以先让学生谈一谈对PCR的认识以及PCR的应用，以激发学生的学习兴趣，然后再说明本课题的目标。
四、基础知识分析与教学建议
（一）PCR原理
知识要点：1.细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件；2.DNA的合成方向；3.Taq DNA聚合酶的应用。
教学建议：理解PCR的原理，需要首先了解细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件。教师在教学过程中，可以首先引导学生回忆必修2《遗传与进化》中的有关DNA复制的知识。在此基础上，学生需要进一步了解DNA双链的方向，能够区分DNA的3′端和5′端。此外，学生还需要了解DNA聚合酶的特性，如只能从DNA的3′端开始延伸DNA链、而不能从头合成DNA等。
Taq DNA聚合酶的应用，解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化，是一个重要的知识点。教师可以结合专题2中课题2“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”Taq细菌的发现过程，帮助学生加深理解。
（二）PCR的反应过程
知识要点：PCR的基本步骤及每个步骤所发生的变化。
教学建议：这部分内容的教学应以读图识图为主。教科书中图5-9“PCR反应过程图解”详细地描绘了参与PCR的各组成成分；每一轮反应的三个基本步骤──变性、复性和延伸；每一轮中每一个步骤所发生的变化，即每个步骤所具有的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。
五、实验案例
PCR扩增双歧杆菌编码16SrRNA的DNA片段
1.双歧杆菌的培养。本实验用双歧杆菌作为实验材料，需要在实验前一天培养双歧杆菌。双歧杆菌的培养基配方如下。
大豆蛋白胨5.0 g 胰胨5.0 g 酵母提取物10 g
葡萄糖10 g 微量盐溶液40 mL 半胱氨酸盐酸盐0.5 g
0.1%（0.1 g/100 mL）刃天青 1 mL
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH至7.0。
其中，微量盐溶液的配方如下。
CaCl2 0.2 g MgSO4•7H2O 0.48 g K2HPO4 1 g
KH2PO4 1 g NaHCO3 10 g NaCl 2 g
培养双歧杆菌24 h后，将菌液进行离心，双歧杆菌将沉淀在试管底部。
2．PCR操作。往双歧杆菌的沉淀中加入0.2 mL裂解液（裂解液配方为50 mmol/ L 的Tris-HCl , 0.5 %的Tween 20, 1 mg/ mL的蛋白酶K，pH为8.0），使细胞裂解，释放出DNA。将裂解液在55 ℃温度下加热孵育3 h后，再在95 ℃温度下加热10 min，然后立即放入冰水中冷却。冷却后离心，将10 μL上清液转移到0.5 mL的离心管中，然后依次加入10倍浓缩的扩增缓冲液5 μL、25 mmol/ L 的MgCl2溶液3 μL，20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL(2U/μL)，蒸馏水29 μL，两种引物(25 μmol/ L) 各0.5 μL。混匀后按教科书表格中的数据设定PCR程序，进行反应。
需要说明的是，进行本实验可以直接购买试剂盒，试剂盒的价格比单独购买试剂的价格要低，并且包括了PCR所需的所有试剂。但是，试剂盒上往往只标出了试剂号，而没有标明试剂的名称，因此购买时要进行详细的咨询。如果单独购买试剂，PCR所需的引物必须委托相关的试剂公司来合成，合成后必须低温保存，否则引物容易发生降解。本实验所用引物的碱基序列如下。
引物I 5′GGATTCTGGCTCAGGATGAACGG 3′
引物II 5′CCGGGTGCTICCCACTTTCATGG 3′( I 代表碱基次黄嘌呤, 它可以与A、G、C、T中的任何1个碱基配对)。
3．PCR产物的检测。产物的检测除了可以采用教科书中提供的方法外，还可以采用琼脂糖凝胶电泳的方法。琼脂糖凝胶电泳的有关介绍可参见本专题中课题3《血红蛋白的提取和分离》以及本课题的参考资料，具体操作步骤如下。
（1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。
（2）配制浓度为1%（1 g/100 mL）的琼脂糖凝胶。在锥形瓶中，称取一定量的琼脂糖粉，加入适量蒸馏水，在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，然后冷却至60 ℃，倒入电泳槽中，待其凝固。
（3）配制0.5倍的TBE电泳缓冲液100 mL。配制方法见本课题的参考资料部分。
（4）向电泳槽中缓缓倒入配制好的电泳缓冲液，以没过胶面2 mm为宜。小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。如果样品孔内有气泡，应设法除去。
（5）在DNA样品中加入相当于样品0.2倍体积的载样缓冲液（载样缓冲液的成分参见本课题中参考资料），混匀后，加入样品孔内。
（6）接通电源。一般红色代表正极，黑色代表负极。DNA样品是由负极向正极移动，因此要保证靠近加样孔一端的电极为负极。电压为1～50 V/cm(长度以两个电极之间的距离计算)。
（7）当指示剂移动到凝胶边缘时，断开电源，终止电泳。一般200～400个核苷酸长度的PCR产物，在50 V电压下，电泳20～40 min即可。
（8）将凝胶放入溴化乙锭溶液中染色后，在紫外仪上观察电泳带及其位置，判断扩增产物的情况。
六、课题成果评价
DNA片段的扩增是否成功
检测DNA片段的扩增情况，既可以采用教科书中提供的方法，也可以采用教师用书中实验案例提供的方法。对于教科书中的方法，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果；对于电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
七、答案和提示
练习
1.提示：绘图可参考教科书中图5-9。PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段（2n=230=1 073 741 824)。
2.提示：PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感兴趣的学生可以参考《分子克隆实验指南》（见本专题参考书目），书中有详尽的论述。
八、参考资料
1.琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围的关系
凝胶浓度要依据DNA分子的大小来确定。编码双歧杆菌16srRNA的DNA片段大小约为1 500个核苷酸的长度，因此根据表4-1选用1％（1 g/100 mL，下同）的凝胶浓度。
表4-1琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围的关系
琼脂糖凝胶浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(千碱基对，kb)
0.3 5～60
0.6 1～20
0.7 0.8～10
0.9 0.5～7
1.2 0.9～6
1.5 0.2～3
12.0 0.1～2
2.核酸电泳缓冲液
核酸电泳缓冲液有三种，分别是Tris—硼酸(TBE)、Tris—乙酸(TAE)和Tris—磷酸(TPE)。在上述三种缓冲液中：TBE与TPE缓冲液容量高，对DNA的分离效果好，但TPE液中含磷酸盐的浓度偏高，容易使DNA沉淀。TAE液的缓冲容量低，价格较便宜。本实验选用的是TBE缓冲液。缓冲液中的EDTA可螯合正价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR产物被降解。
10倍浓缩的TBE缓冲液配方如下。
Tris　　108 g　　EDTA　9.3 g　硼酸　　55 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH为8.0～8.2备用，使用时需稀释10倍。
3.核酸电泳的指示剂与染色剂
核酸电泳常用的指示剂是溴酚蓝，溴酚蓝在碱性条件下呈蓝紫色。指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。载样缓冲液的作用是：能够增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔内；能够在电泳中形成肉眼可见的蓝紫色指示带，从而帮助预测核酸电泳的速度和位置；能够使样品呈现蓝紫色，使加样操作更方便。
核酸电泳后，需要染色才能在紫外线下观察到带型。最常用的染色方法是溴化乙锭染色法。溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，有剧毒，因此操作时要非常小心。EB可嵌入DNA双链的碱基对之间，在紫外线激发下，能发出红色荧光。染色的方法有两种。一种是在凝胶电泳液中加入EB，使其终浓度为0.5 μg/mL；一种是在电泳后，将凝胶浸入0.5 μg/mL的EB溶液中，染色10～15 min。当凝胶染色过深时，可以将凝胶放入蒸馏水中浸泡30 min后再观察。
4.PCR的常见问题
PCR实验很容易出现假阳性或假阴性的结果。出现假阴性结果的常见原因有：Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统的建立欠妥当；循环次数不够；等等。当实验中出现假阴性的情况时，应首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶，并增加5～10次循环。为了防止假阴性结果的出现，在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时，在提取DNA模板时，应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度的要求不高，但也不允许有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低，很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况，尤其需要保证引物的3′ 端与靶基因互补。
PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增，因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原因。此外，样品中存在靶基因的同源序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果，PCR操作时要注意做到：隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头等。