1.基因表达载体中的启动子和终止子是原来就有的还是后插入的？
在基因工程构建基因表达载体步骤中，不少同学认为基因表达载体中的启动子和终止子要么是原来质粒中的，要么是原来目的基因上的。其实不然，启动子和终止子都是后来加入的。在目的基因的前′端加上启动子，在后端加上终止子，以便外源基因在受体细胞中有效的表达。目前植物基因工程中最常用的启动子是从花椰菜花叶病毒中分离出来的35S启动子，其次是胭脂碱和章鱼碱合成酶的Nos启动子和Ocs启动子。植物基因工程中常用的终止子是胭脂碱合成酶的Nos终止子和Rubisco小亚基基因的3′端区域。
2.蛋白质工程是属于基因突变还是属于基因重组？
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。采用基因重组技术或人工合成DNA，不但可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质。蛋白质工程要利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。基因定点突变技术是指通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术。在基因定点突变技术中一般采用寡核苷酸诱导的定点突变方法，定向地改变基因的序列结构，这一方法已成为当前蛋白质工程中改变基因的主要方法。这项技术主要是利用带有预定突变序列的寡核苷酸单链引物，在体外与原基因序列退火，诱导合成少量完整的突变基因，然后通过体内增殖得到大量的突变基因。因此可以认为蛋白质工程操作中在对基因进行定向突变时是属于基因突变，而将修饰后基因导入受体细胞则采用的是基因工程技术。
3.如何从基因文库中找到所需要的基因？
从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进行。下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。
第一步，通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法进行，如生物素、荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，与扩增出来的DNA杂交。
第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上（也可以用其他类型的膜），然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在膜上。
第三步，按Southern杂交的方法进行杂交。
第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）。
第五步，从该菌落中再提取目的基因。
4.什么是分子杂交技术的显示带？
分子杂交技术是基因工程中使用频率很高的一项技术，主要用于检测和鉴定，可以分为核酸分子之间的杂交和蛋白质分子之间的杂交。常用的技术有：
Southern杂交──DNA和DNA分子之间的杂交。目的基因是否整合到受体生物的染色体DNA中，这在真核生物中是目的基因可否稳定存在和遗传的关键。如何证明这一点，就需要通过Southern杂交技术。基本做法是：第一步，将受体生物DNA提取出来，经过适当的酶切后，走琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的片段分开；第二步，将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上；第三步，用标记了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交；第四步，将X光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光；第五步，将X光底片冲洗，如果在底片上出现黑色条带，则表明受体植物染色体DNA上有目的基因。
Northern杂交──DNA和RNA分子之间的杂交。它是检测目的基因是否转录出mRNA的方法，具体做法与Southern杂交相同，只是第一步从受体植物中提取的是mRNA而不是DNA，杂交带的显现也与Southern杂交相同。
Western杂交──蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。具体做法是：第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。
5.基因沉默
转基因植物和转基因动物中往往会遇到这样的情况，外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低，这种现象称为基因沉默（gene silence）。这是基因工程中遇到的一个影响实际应用的重要问题。一般认为基因沉默有三种情况：位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默。如果外源基因整合到甲基化程度高、转录活性低的异染色质上，一般不能表达，这种现象称为位置效应产生的基因沉默。如果外源基因的启动子产生甲基化，或者外源基因异染色质化都会使外源基因不能转录，产生转录水平上的基因沉默。如果外源基因可以转录出mRNA，但mRNA不能积累，或被降解，或被相应的RNA或蛋白质封闭，使之不能翻译出蛋白质，称为转录后水平的基因沉默。
如何避免基因沉默呢？这是科学家一直在努力解决的问题之一。目前主要的对策是在构建表达载体时，应可能避免外源基因与内源序列同源性过高，或者选择甲基化酶活性低的受体细胞，或选择外源基因在生物体内为单拷贝的转基因生物。
6.无抗性选择标记基因的策略
当前转基因植物中大部分都是使用了抗生素抗性基因作为选择标记基因，由于担心这样做会对人类健康和环境带来负面影响，因此，科学工作者正在想办法消除转基因植物中的抗性基因。基本的做法有两种：一是将抗性选择标记基因和目的基因分别构建在两个不同的表达载体上，用这两种载体同时转化受体细胞，通过筛选和分子检测找到同时含有抗性筛选标记基因和目的基因的植株，通过自交，在F1代分离时，由于抗性筛选标记基因和目的基因不是在一个表达载体上，它们整合到受体细胞染色体DNA上时不在同一个位点上，两者相距较远，不会连锁，因此分离时可以将二者分开，分别存在于不同的植株中，这样就可以得到含有目的基因而不含抗性筛选标记基因的植株。二是采用位点专一性重组系统，通过重组酶的作用将抗性筛选标记基因从转基因植株的DNA中切除掉。
7.蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？
答：基因工程是遵循中心法则，从DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。
8.你知道酶工程吗？绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质工程有什么区别？
通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。
鸟枪法是将目的DNA随机地处理成大小不同的片段，再将这些片段的序列连接起来的测序方法。大致步骤 1.使用限制性内切酶将带有目的基因的DNA链切成若干小段。 2.再使用DNA连接酶将其整合到载体的基因中,并使其表达。 3.如果在某个细胞中得到了目的产物,就说明整合到该细胞中的DNA片段就是所需要的DNA片段鸟枪法优点是速度快，简单易行，成本较低。
毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：
（1）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。
（2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。
9、有关质粒的资料
必修2：质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物的细胞中，是拟核或细胞核外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
选修3：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
普通生物学：质粒是一些在细菌中独立存在于其染色体之外的，能够自主复制的小型环状DNA分子，只有酵母中的杀伤质粒是RNA分子。
基因工程原理与应用：质粒是染色体外能自我复制的小型DNA分子。它广泛存在于细菌细胞中，也存在于霉菌、蓝藻、酵母和少数动植物细胞中，甚至线粒体中都发现有质粒的存在。
基因的克隆载体：质粒（plasmid)是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子，它广泛存在于细菌细胞中。在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。目前对细菌质粒研究的较为深入，在基因工程中，多使用大肠杆菌质粒为载体。
总结：
1.存在：主要存在于细菌细胞中，有些真核细胞也有。
广泛存在于细菌细胞中，也存在于霉菌、蓝藻、酵母和少数动植物细胞中，甚至线粒体中都发现有质粒的存在。《基因工程原理与应用》
2.都是DNA吗？
是拟核或细胞核外能够自主复制的很小的环状DNA分子。只有酵母中的杀伤质粒是RNA分子。（普通生物学）
3.哪些细胞含有质粒?
真核细胞的质粒
在细菌中存在着质粒这是为大家熟知的现象，然而在真核生物的细胞中也有质粒存在，只不过不是像细菌那样普遍而以。由于质粒一般和核染色体没有关系，因此表现出一种非孟德尔式遗传模式，和细胞器DNA的一些传递途径较为相似。
大部分真核质粒没有明显的表型效应，只能用一些分子水平的技术才能检测到它。搞得最清楚的就是酵母的2μ环（two-micron circle）。这个环状质粒可能位于核质。若一个含有此质粒的单倍体品系与另一个丢失了些质粒的品系接合，无论是有性还是无性后代都获得了此质粒。2μ质粒在基因工程中可作为载体而显示了它的重要性。当将核DNA拼接成2μ载体并用于转化受体细胞时，插入片段被带到核中，在核中它可能通过各种重组机制掺入到染色体中。
然而部分真核质粒是线粒体的。一个有趣的线粒体质粒是和玉米的细胞质雄性不育有关。在植物中雄性不育品系产生的花粉是没有功能的。当将雄性不育植物作为母本与正常可育的植物（作为父本）进行杂交时所产生的后代全部都是雄性不育的，这种遗传方式明显属于母体遗传。玉米中细胞质雄性不育是和两种线状质粒有关，即S1和S2。它们位于线粒体中，附加在mtDNA上。虽然对这些质粒的分子特点已搞得较清楚，但还未能用精确地方法充分证明它们和雄性不育的关系。一个有趣的特点是S1和S2能与mtDNA重组。
另一个很好的真核质粒的例子是在脉胞菌中一种衰老品系,,在一般的培养基上不能生长，不久死亡。在夏威夷发现了这种群体，人们称这个品系为“Kalilo”，夏威夷语的意思就是“死亡之门”。Kalilo品系仅在穿入培养基一定的深度时才能生长，然后就会死去，在未死前将这个品系进行杂交，其致死能力将以母体遗传的方式传递给后代。现已发现这种衰老的特征是由一长9Kb的线粒体质粒决定的，这种质粒叫做Kal DNA，它可以独立存在于细胞质中，而且是无害的。但一插入到mtDNA中就可引起逐步死亡。在死掉的细胞中，大部分mtDNA分子都有Kal DNA的插入。推测这个品系的衰老和死亡可能由于插入KalDNA的干扰或破坏坏了线粒体的正常功能。因此看来Kal DNA就像是个“分子寄生虫”。
值得注意的是在上述例子中这些质粒和玉米，脉胞菌的缺陷型表型有关联，但酵母的2μ质粒没有明显的表型效应。真核质粒的存在和进化的地位仍然是个迷。但研究这些因子的结构和行为对于搞清遗传物质的基本特点可提供重要的思路。
一个在酵母中发现的质粒：
1973年，Cohen和Boyer体外构建一个功能性质粒，标志着一个新的学科基因工程诞生，同时也标志着一个新的技术产生——现代生物技术产业从这里萌芽。
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